Le microscope confocal est un microscope optique qui a la propriété de réaliser des images de très faible profondeur de champ (de 150 à 400 nm environ) appelées « sections optiques ». En positionnant le plan focal de l'objectif à différents niveaux de profondeur dans l'échantillon, il est possible de réaliser des séries d'images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l'objet. L'objet n'est donc pas directement observé par l'utilisateur ; celui-ci voit une image recomposée par un logiciel dédié.



Le microscope Nikon A1 Rsi est adapté à l'imagerie confocale en système fixé ou vivant (température/CO2 contrôlés),

Des rais laser à 405, 457, 488, 514, 568, 647 nm modulés par AOTF sont utilisés afin d'illuminer l'échantillon, le signal fluorescent émis est détecté, amplifié et converti par des tubes photomultiplicateurs PMT.


L'acquisition de piles d'images particulièrement bien résolues en Z permet de reconstruire en 3 dimensions l'objet analysé:




Série d'images suivant l'axe Z



reconstruction en 3D de la même série d'images




Acquisition confocale de cellule épithéliale Caco2 (vert) et de cellule du système nerveux entérique (rouge et blanc)  (Duchalais E., 2015)

Imagerie Haute Vitesse


Le microscope A1 est doté d'un scanner dit "resonant" permettant de réaliser des images à haute vitesse (jusqu'à 420images/sec en 512x32 pixels) en mode résonnant


Tête de scan du Nikon A1

De plus, la platine est dotée d'un système piezo-électrique autorisant des déplacements en Z très rapide


Déconvolution Spectrale


Acquisition d'images spectrales (32 canaux) et séparation spectrale en temps réel. Ce système de détection permet de séparer le spectre d'émission d'un échantillon en 32 canaux, et ce jusqu'à une sensibilté de 2.5 nm. Un tel procédé permet de séparer 2 (ou plusieurs) fluorochromes dont les spectres d'émission sont très proches, ainsi que d'isoler un marquage spécifique d'une autofluorescence indésirable.





Exemple de séparation spectrale d'un marquage au sein d'un tissu autofluorescent:


 

Mesures de Dynamiques de Fluorescence


Imagerie par photoactivation/photobleaching (FRAP, FLIP etc...)

La mesure de retour de fluorescence après photo-blanchiment (Fluorescence Recovering After Photobleaching; FRAP) peremt de mesurer des dynamiques à l'échelle moléculaire telles que la mobilité d'une molécule marquée, son éventuelle multimérisation, le passage d'un compartiment subcellulaire à un autre etc...